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实时荧光定量 PCR 技术研究进展及其应用
2013-12-18
       摘要:实时荧光定量PCR技术是在PCR反应体系中加入荧光染料或荧光探针,利用荧光信号积累实时监测整个PCR反应进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析,具有操作简便快速高效,高通量,而且高敏感性等特点,该技术在分子诊断分子生物学研究动植物检疫以及食品安全检测等方面有广泛的应用文章对实时荧光定量PCR的原理影响因素以及在植物病害和遗传育种方面的应用等进行了综述。 

       关键词:实时荧光定量PCR;分类;影响因素;应用

       中图分类号:Q503   文献标志码:A   文章编号:1005-9369(2010)08—0148—08

       Advance and application of real-time fluorescent quantitative PCR/CHEN Xu,QI Fengkun,KANG Ligong,LI Jingfu(College of Horticulture,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China)

       Abstract:Real-time fluorescent quantitative PCR,in PCR reaction system by adding fluorescent dyes or fluorescent probes,real-time monitoring of fluorescence signal accumulation process of the PCR reaction,standard curve by quantitative analysis of the unknown template,simple,fast,efficient,high-throughput and the character is tics of high sensitivity.The technology in molecular diagnostics,molecular biology,animal and plant quarantine and food safety testing has a wide range of applications.Article on the principle of real-time fluorescent quantitative PCR,factors and plant diseases and genetic breeding of the application were reviewed.

       Key words:real-time fluorescent quantitative PCR;classification;factors;application

       自1985年,美国Perkin-Elmer Cetus公司人类遗传研究室Mullis等发明了具有划时代意义的聚合酶链反应(Polymerase chain reaction,PCR),使人们梦寐以求的体外无限扩增核酸片段的愿望成为现实,但是,利用传统的PCR技术进行检测鉴定时,需要进行扩增反应后的电泳分离及染色处理,且不能准确定量,使其应用受到限制[1]。1992年,Higuchi最早提出了实时PCR的设想[2],它的基本思想是利用荧光染料EB(溴化乙锭)可以插入到双链核酸中受激发光的性质,在PCR反应的退火或延伸时检测掺入到双链核酸中EB的含量就能实时监控PCR反应的进程,根据PCR反应的数学函数关系,结合相应的算法,通过加入标准品的方法,就可以对待测样品中的目标基因进行准确定量。但Higuchi利用的是嵌入荧光染料检测,它只能简单地反映PCR反应体系中总的核酸量,是一种非特异性的检测方法。直到1995年,美国PE公司研制成功具有革命性意义的荧光定量PCR技术,融合了PCR高灵敏性、DNA杂交的高特异性和光谱技术的高精确定量等优点,直接探测PCR过程中荧光信号的变化,以获得特定区段扩增产物定量的结果,不需要PCR后处理或电泳检测,完全闭管操作(整个过程中仅有加入样品的一次开盖),一举克服了常规PCR技术的诸多难题。具有诸多优点:①它不仅操作简便、快速高效、高通量,而且具有很高的敏感性、重复性和特异性;②由于是在封闭的体系中完成扩增并进行实时测定,大大降低了污染的可能性并且无须在扩增后进行操作;③有很大的动力学范围,可以在很大浓度范围内(>107倍)进行定量;④既可以做定量分析又可以做定性分析;⑤它还可以通过不同的引物设计在同一反应体系中同时对多个靶基因分子进行扩增,即多重扩增。

       实时荧光定量PCR技术发明至今,人们利用实时荧光定量PCR技术本身的优越性把其广泛运用于医学诊断、海关检验检疫、国防军事、新型农业、基础研究等领域。目前尤其在动物医学病理和分子生物学研究领域应用十分广泛。而实时荧光定量PCR技术在植物病害遗传育种研究上的报道较少,但是最近几年实时荧光定量PCR技术的发展有力地促进了植物病害检测研究水平的提高,加快了植物遗传育种的进度,而且发挥着越来越重要的作用。本文对实时定量PCR的原理、影响因素以及在植物方面的应用等进行了综述。

       1、实时荧光定量PCR技术的原理

       实时荧光定量PCR的原理是以荧光共振能量转移原理为基础。荧光共振能量转移原理是当一个荧光分子(供体分子)的荧光光谱与另一个荧光分子(受体分子)的激发光谱重叠时,供体荧光分子自身的荧光强度衰减,受体荧光分子的荧光强度增强。Ct值是指每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数。Ct值是实时荧光PCR中一个很关键的因素,C代表循环(Cycle),t代表阈值(Threshold)。每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系,起始拷贝数越多,Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可做出标准曲线。因此,根据荧光探针的发光基团所发出的荧光强度与PCR产物的数量呈对应关系,只要对荧光信号进行“实时”检测并获得未知样品的Ct值,即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。与普通PCR相比,实时荧光定量PCR可以利用荧光信号实时监测PCR反应过程中每一个循环扩增产物的变化,可以对初始模板量进行定量分析。
 
       简单地说,实时荧光定量PCR的基本原理就是样本核酸扩增呈指数增长,在反应体系和条件完全一致的情况下,样本DNA含量与扩增产物的对数成正比,由于反应体系中的荧光染料或荧光标记物(荧光探针)与扩增产物结合发光,其荧光量与扩增产物量成正比,因此通过荧光量的检测就可以测定样本核酸量。

       2、实时荧光定量PCR技术中荧光标记方法的分类

       目前,real-time Q-PCR所使用的荧光化学方法主要有四种,分别是DNA结合染料法、水解探针法、杂交探针法、荧光引物法。它们又可分为扩增序列非特异和扩增序列特异两类检测。

       2.1 非特异性的DNA结合染料法

       荧光染料能结合在DNA双链结构的小沟中,而游离的荧光染料不发出荧光,因此扩增开始时检测不到荧光信号。随着扩增的进行,荧光染料与逐渐增多的dsDNA结合,荧光强度逐渐增强,直到达到阈值,被荧光探测系统检测到[3]。通过对已知拷贝数,不同稀释倍数的阳性模板做荧光定量PCR,即可做出标准曲线。未知样品通过与标准曲线比较,即可得出定性和定量的结果。在反应体系中,其信号强度即代表了双链DNA分子的数量。研究中常用染料有Pico Green和SYBR GreenⅠ。Pico Green是一种新型的染料,与SYBR GreenⅠ相比,其灵敏度较高,可以检测出至少25pg·mL-1的dsDNA分子,且具有线性范围广,RNA、ssDNA及其他物质的影响小的优点[4]。具体工作原理见图1。荧光染料法其优势在于检测方法简便,检测成本低。不足之处是由于染料与DNA双链分子的结合是非特异性的,它可以和反应体系中的所有DNA分子结合,因此易受到非特异性扩增和引物二聚体的影响,使定量结果不可靠。所以,其特异性不如探针法。针对这一问题可以借助融解曲线分析法来区分非特异性产物和引物二聚体而排除假阳性。此外,也可以通过设计特异性引物、优化PCR的反应条件,减少或去除非特异性产物和引物二聚体的产生以提高特异性进行定性诊断。
 
 
       2.2 特异性荧光定量PCR

   特异性荧光定量PCR的基本原理是以荧光共振能量转移原理为基础的。荧光共振能量转移原理是当一个荧光分子(又称为供体分子)的荧光光谱与另一个荧光分子(又称为受体分子)的激发光谱相重叠时,供体荧光分子的激发能诱发受体分子发出荧光,同时供体荧光分子自身的荧光强度衰减,这种现象即是荧光FRET。FRET的发生与供、受体分子的空间距离紧密相关,7~10nm时即可发生。随着空间距离的延长,FRET现象显著减弱。当PCR反应开始后,根据荧光共振能量转移的原理,荧光探针的发光基团所发出的荧光强度与PCR产物的数量呈对应关系,因此对荧光信号进行检测即可实现对PCR产物的准确定量[5]。

       2.2.1 水解探针法

       TaqMan探针是应用最广的水解探针,其原理主要是在PCR反应体系加入一个特异的荧光标记探针,根据FRET原理,当探针保持完整时,3'端淬灭基团抵消了5'端发射基团的荧光发射,这时检测不到荧光信号(见图2)。在PCR的退火期,探针与模板发生特异性杂交,当延伸期引物在Taq酶作用下沿DNA模板延伸到达探针处,由于所用Taq酶具有5'→3'外切活性,发生置换反应,使5'端标记荧光发射基团FAM(6-羧基荧光素)与3'端标记荧光淬灭基团TAMRA(6-羧基四甲基若丹明)分离,荧光信号得到释放,这时荧光探测系统就能检测到光密度的增加。模板每复制1次,就有1个探针被切断,伴随着1个荧光信号被释放。由于理论上被释放的荧光基团数和PCR产物数是一对一的关系,因此,可根据PCR反应液中的荧光强度即可计算出初始模板的数量[6]。

       2.2.2 分子信标

       分子信标,亦称分子灯塔,由Tyagi和Kram-mer建立[7]。该种探针是一段茎环发夹结构的单链DNA分子,环部与靶DNA序列互补,为约15~35bp,茎部由GC含量较高的与靶DNA无序列同源性的互补序列构成,约8bp,探针的5'端与3'端分别标记荧光报告基团和荧光淬灭基团。当分子信标处于自由状态时,发夹结构的两个末端靠近使荧光报告基团与淬灭荧光基团靠近,荧光信号被淬灭。当有靶序列存在时,分子信标与靶序列结合,使分子信标的茎秆区被拉开,3'端与5'端分离,此时荧光报告基团不能被淬灭,荧光检测仪器可检测到荧光。随着每次扩增产物的积累,荧光强度增加,可反映出每次扩增末扩增产物积累的量。分子信标法的特点是探针可循环利用,理论上分子信标能区分仅单个核苷酸差异的DNA,特异性比常规等长的寡核苷酸探针更明显。但探针标记较复杂,并且要求游离在溶液中时探针能无选择性折叠,否则会造成部分荧光本底信号;同样,当茎结构的热力学温度过高时,则会影响探针与靶序列杂交。

       2.2.3 Scorpion引物/探针

       由1条发夹结构的探针和1条引物构成,探针的5'端和3'端分别标有报告荧光和淬灭荧光,3'端通过1个非扩增的单体(防止探针退火后的延伸)与引物的5'端相连[8]。在探针上由于荧光报告基团与淬灭基团相互靠近,不发荧光。变性阶段,探针的发夹结构会解开,在退火时则与模板相结合,形成线性分子,报告基团同淬灭基团分离而发射荧光。因此可检测到报告荧光发出的荧光信号。由于Scorpion引物/探针中序列特异性引物和探针在同一分子上,因此信号的产生特别快。在探针的设计上,要求绝对保守,长度为25~32bp,Tm在68~70℃之间,探针的5'端不能为G,避免多个碱基同时出现,尤其要避免4个G同时出现;另外,探针应靠近上游引物(见图3)。

       2.2.4 双链探针

  双链探针又称为复合探针,由互补的两条链构成。长链的5'端标记报告基团,3'端磷酸化,短链的3'标记淬灭基团。没有靶核苷酸存在时,两条链形成复合体,不发出荧光。当有靶序列存在时,带有报告荧光基团的长链探针先和靶结合,发出荧光。双链探针设计简单,成本低廉,特异性可通过改变两条寡聚核苷酸相差的碱基数进行灵活控制[9]。具体工作原理见图4。

 

       3、影响实时荧光定量PCR试验结果的因素


       从DNA出发进行定量相对比较简单,一般在保证引物及探针的特异性、PCR反应体系的合理性以及DNA模板的纯度和完整性的情况下,可以保证试验的顺利进行。从RNA出发对mRNA进行定量时,操作比较复杂,影响试验结果的因素也比较多。


       3.1 RNA的完整性


       因为RNA一旦降解所定量的结果就不能正确反映样品中mRNA的量,所得的结果也是错误的。所以在RNA提取过程中要严格遵守操作规范,避免RNA酶的污染[10-11]


       3.2 RNA样品中的基因组DNA污染

 

       提取的RNA样品中不可避免地混有少量的基因组DNA。基因组DNA对试验有两个影响:一是影响对RNA的精确定量;二是影响PCR扩增的特异性。
 

       3.3 PCR反应体系的优化


       PCR扩增过程必须保证扩增产物只有特异的目标产物,为此,首先要保证PCR反应体系达到最优。目前许多公司都有用于实时定量PCR反应的试剂盒,可以方便PCR反应的操作。

 

       3.4 反转录

 

       反转录所得cDNA的量必须精确地等于相应的mRNA的量,反转录对于实时定量PCR来说是非常关键的一步。目前常用的反转录酶有2种:AMV-RT和MMLV-R。反转录常用的引物有随机引物、Oligo-dT和特异引物。相比之下Oligo-dT和特异性引物更适合实时定量PCR[12]。
 

       3.5 利用实时定量PCR研究基因表达时,一般用相对定量的方法

 

       相对定量必须用到内标基因。可靠的内标基因应是在不同细胞类型、不同试验条件下都稳定表达的持家基因。常用的内标基因有β-tublin、actin、GAPDH、18sRNA、efla和Cyclophilin等[13]。尽管在大多数情况下这些持家基因的表达非常稳定,但是最近有报道认为这些持家基因的表达在某些情况下会发生变化。也就是说并不是任何内标基因都适合任何试验。在选择内标基因时,应仔细考虑各种因素,选择合适的内标基因或内标基因组合。


        4、实时荧光定量PCR在植物上的应用


       4.1 实时荧光定量PCR在植物病理学研究中的应用


       传统的病原菌检测方法依赖于症状观察、孢子或菌落计数等手段。与传统方法相比,实时定量PCR技术具有快速、灵敏、特异等优点,不受植物症状的限制,能区分细微差异。目前该技术在植物病原菌检测中得到越来越广泛的应用。如伍永明,张祥林,罗明等根据西瓜细菌性果斑病菌(Acido-vorax avenae subsp.citrulli)与相关细菌16S rDNA序列差异,设计出对西瓜细菌性果斑病菌具有稳定点突变特异性探针Aac-probe,利用该探针对23种供试菌株进行了实时荧光PCR检测试验[14]。结果表明,只有西瓜细菌性果斑病菌能检测到荧光增强信号,其他细菌无荧光增强信号。该方法特异性强,灵敏度高,重复性好,可有效地应用于西瓜细菌性果斑病菌的检测。王超和孟祥晨等根据双歧杆菌高度保守的寡核苷酸序列,构建一枚荧光分子信标探针,并对探针的性能进行测定分析,利用实时PCR技术对双歧杆菌进行检测[15]。研究结果表明,所构建的分子信标设计合理,合成正确,性能稳定,S/N>20,其发卡既可以闭合也可以打开,符合实时PCR过程对分子信标的要求;该信标探针对双歧杆菌具有很好的稳定性及特异性,通过实时PCR扩增能有效地将双歧杆菌和非双歧杆菌区别开。
 

       4.1.1 在病原真菌研究中的应用


       Min等用实时定量PCR(SYBR)检测了稻瘟病菌在侵染水稻不同时期的生物量,证明了该方法是一种可用于分析真菌病原菌致病性和寄主抗性的很好的工具[16];Bohm等报道了用实时定量PCR(TaqManTM)检测马铃薯晚疫病菌和柑橘生疫霉病菌的方法[17];Lees等报道了实时定量PCR技术是检测立枯丝核菌AG-3的灵敏而又特异的方法[18];2002年程颖慧等报道了小麦印度腥黑穗病的实时荧光定量PCR检测[19];高强等通过对小麦矮腥黑穗病菌(TCK)及其近似种小麦网腥黑穗病菌(TCT)和小麦光腥黑穗病菌(TFL)的rDNA序列ETS区域测序比较分析,找出TCK的特异性序列并设计了实时荧光PCR探针,从分子生物学上成功利用实时荧光定量PCR技术对TCK的检测,大大提高了对TCK检验检疫的准确性和效率[20]。黄国明等设计了通用TaqMan探针及引物和特异TaqMan探针及共用引物,结合通用探针的单色荧光PCR和特异探针的双色荧光PCR两种方法,成功摸索出一种N.coenophialum和N.lolii的菌丝及单粒种子快速、稳定、可靠、特异性强的荧光PCR检测方法,使检测时间由至少一个月缩短至7~8 h,而且检测灵敏度达到单粒种子[21];苏丹等选取内生真菌特异性引物,成功设计并建立了利用实时荧光定量PCR技术对黑麦草中内生真菌感染情况的检测和定量分方法[22]。另外,实时定量PCR还可以用来检测食品中的真菌毒素。利用该技术,Mayer等对食品中的黄曲霉毒素进行了检测[23],Schnerr等检测了小麦中镰刀菌产生的单端孢菌毒素,结果证明该技术是检测食品中真菌毒素的灵敏方法[24]。此外,该技术在研究真菌病害的侵染规律、防止真菌病原物传播等方面也有应用[25-26]。


       4.1.2 在病原细菌检测中的应用


       在病原细菌检测方面,更多的是利用实时定量PCR与培养分离相结合的方法,称之为real-time Bio-PCR。利用荧光定量PCR技术准确成功鉴定的有番茄溃疡病菌[27-28]、柑桔溃疡病[29]、玉米细菌性枯萎病菌[30]、梨火疫病菌[31]、菜豆细菌性萎蔫病菌[32]、苜蓿细菌性萎蔫病菌[33]、香蕉枯萎细菌性病菌[34]、西瓜细菌性果斑病菌[35]、马铃薯环腐病菌、青枯劳尔氏菌、燕麦食酸菌、柑桔黄龙病[36-37]、稻白叶枯病菌等细菌的检测。如夏明星和赵文军等根据ITS序列多态性设计引物及TaqMan探针进行了番茄细菌性溃疡病菌的实时荧光PCR检测,结果表明,设计的这组引物-探针能检测出所有供试的Cmm菌,对照菌均未检测到荧光信号[27]。用接种但未显示症状的番茄苗叶片及人工处理的带菌种子提取的核酸作为模板,均能检测到病菌,其检测灵敏度比常规PCR高约100倍。实验中不需病原菌的分离培养及PCR的后续处理。该方法快速、简便、安全、准确,适用于出入境检验检疫及种子、种苗健康检测领域。


       4.1.3 在植物病毒检测中的应用

 

       由于病毒本身核酸序列较为简单,而且大量病毒的核酸序列已经报道,所以用PCR技术来检测植物病毒非常方便。郑耘等应用直接结合反转录实时荧光PCR技术检测烟草环斑病毒[38];与此同时杨伟东等应用免疫捕捉反转录实时荧光PCR技术(IC-RT-Realtime PCR)成功检测烟草环斑病毒,由此解决了烟草环斑病毒检测工作中由于隐症、干扰物质存在而影响检测结果的问题[39];利用TaqMan探针实时定量PCR技术,Roberts等检测到了500 fg水平的番茄斑萎病毒(TSWV)[40];Eun等同时检测出5 fg水平的建兰花叶病毒(CyMV)和齿兰环斑病毒(ORSV)[41]。


       此外在植原体导致的植物病害上,廖晓兰等根据植原体16S rDNA保守区设计了3个植原体组间点突变特异性探针和1个TaqMan广谱探针,选取植原体和细菌以及植物样本进行实时荧光定量PCR,成功建立了植原体分类鉴定和检测的Taq-Man探针实时荧光定量PCR方法[42]。

 

       4.2 荧光定量PCR技术在植物遗传育种中的应用


       荧光定量PCR技术目前应用最为广泛的是医学领域,例如病毒、细菌、病原体的定量监测及治疗药效评价,基因的点突变及单核苷酸多态性(SNP)分析,肿瘤基因的检测和诊断等等。最近几年来,在植物遗传育种领域的应用也不断增多。
 

       4.2.1 目标基因检测或诊断

 

       植物抗病性及其机制研究一直是当今植物病理学和植物抗病育种研究工作中的热点和焦点问题。而抗病基因的研究是植物抗病性及其机制研究的基础,运用荧光定量PCR技术可检测转入抗病基因的植株中病毒的积累[43],从而比较抗病植株与感病植株之间的病毒复制和积累的差异,为抗病基因抑制病毒的复制和运动提供强有力的分子证据。刘凌凤等利用分子信标探针对烟草花叶病毒基因组RNA的检测[44];刘晓东、张增艳等采用半定量RT-PCR的方法,研究了大麦黄矮病毒GAV株系在YW 642及其感病姊妹系YW641中积累的差异[45]。郭兆奎等依据实时定量PCR原理,参照35S启动子、MOS终止子、GUS基因和NPTII基因序列,设计TaqMan引物和荧光标记探针建立了转基因烟草的定量检测方法[46]。刘桂丰、程贵兰等以小黑杨(Populussimonii×P.nigra)花粉植株叶片为外植体,用根癌农杆菌介导法将胆碱脱氢酶基因(betA)导入其中,用荧光定量PCR对转基因株系的betA基因转录结果进行了耐盐性检测[47]。


       4.2.2 基因突变分析及多态性研究


       利用SYBR GreenⅠ作熔链曲线,根据Tm值的大小,可分析基因小片断上的碱基突变;利用荧光实时定量PCR和有关的间接测序方法可以对已知DNA序列进行位置突变基因及序列多态性的定位,扩增DNA限制性位点检测遗传变异等。如Sevall等证明可用实时定量PCR方法区分含有突变的等位基因。
 

       5、结语和展望


       荧光定量PCR技术自建立以来,发展迅速、应用广泛,表明其具有强大的生命力。由于具有定量、特异、灵敏和快速等特点,是目前检测目的核酸拷贝数的可靠方法,在植物上得到广泛的应用。近些年来,许多科研工作者基于荧光PCR的基本原理对荧光PCR技术进行不断深入的研究和改进,使荧光PCR技术得到了进一步的完善,并在此基础上开发出了许多新的荧光定量PCR技术。随着科技的发展,功能更强大、操作更方便的实时定量PCR仪不断推出,更特异、更灵敏的荧光标记材料的不断出现,数据分析软件的不断改进更新,使得实时定量PCR技术的应用前景更加广泛,使之成为生物定量分析的强有力手段。TaqMan和分子信标荧光探针是目前用于荧光定量PCR检测的主流,但都存在各自的优缺点,其他荧光探针都是在此基础上为了克服它们的不足而设计出来的,随着探针技术的发展,更特异更稳定的探针将会出现。随着荧光定量PCR技术及相关技术的进一步发展,再结合其他检测技术(如生物芯片技术),将荧光定量PCR用于除植物病害和遗传育种外的其他领域,是当前荧光定量PCR技术在植物中的发展趋势。

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